乙醇脫氫酶（ADH）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

                                              微量法 100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

ADH是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換，在很多生理過(guò)程中起著重要作用。哺乳動(dòng)物ADH主要在肝臟生成，肝臟損傷導(dǎo)致ADH釋放到血清中。血清ADH活性高低反映了肝功能是否異常。

測(cè)定原理：

ADH催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD⁺，NADH在340nm處有吸收峰，而NAD⁺沒(méi)有；測(cè)定340nm 吸光度下降速率，來(lái)計(jì)算ADH活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，室溫保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。              

試劑三：粉劑×2瓶，－20℃保存，臨用前每瓶加入9mL試劑二，現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑四：液體×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

1、   組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測(cè)。

2、   細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；16000g， 4℃離心20min，取上清液置冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

ADH測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三在25℃水浴中保溫30 min。

3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μL樣本上清液、160μL試劑三和20μL試劑四，迅速混勻后于340nm測(cè)定吸光值變化，分別記錄15s和75s時(shí)吸光值，分別記為A1和A2。△A測(cè)定管=A1-A2。

計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷(Cpr×V樣)÷T

=1608×△A ÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/g 鮮重) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹)÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/10⁴cell) = (△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷V樣÷T

=1608×△A

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷(Cpr×V樣)÷T

=3215×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/g 鮮重) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T

=3215×△A÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/10⁴cell) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=3215×△A÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×10⁹) ÷V樣÷T

=3215×△A

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5 cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W ：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

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