【產(chǎn)品名稱】

商品名稱： 鵝流感病毒通用型（GIV-U）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name： Goose Influenza Virus Detection Kit （Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】25T/盒、50T/盒

【預期用途】

鵝流行性感冒(goose influenza)簡稱鵝流感，是由 A 型流感病毒中的某些致病性血清亞型毒株引起的全身性或呼吸器官性急性傳染病，主要發(fā)生于 30 日齡內(nèi)的小鵝。鵝流感的發(fā)病率逐年增加，大多是因為氣候突然變化， 飼養(yǎng)管理不善，小鵝受寒而感染，死亡率一般為 50%~90%。

本試劑盒適用于檢測拭子樣品、氣管、肺、腦、腸（包括內(nèi)容物）、肝、脾、腎、心等組織臟器中鵝流感病   毒 RNA，適用于鵝流感病毒感染的診斷、檢疫、檢測、監(jiān)測和流行病學調(diào)查等。

【檢驗原理】

本試劑盒針對鵝流感病毒 M 基因高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術對鵝流感病毒 RNA 進行體外擴增檢測，用于科研上對可疑感染病料的病原學檢測。

【試劑組成】

包裝規(guī)格25T/盒50T/盒

GIV-U 反應液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

GIV-U 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

拭子樣品：采集咽喉拭子時將拭子深入喉頭及上顎裂來回刮 2 次~3 次并旋轉，取分泌液；采集泄殖腔拭子時將拭子深入泄殖腔至少旋轉 3 圈并沾取少量糞便；將采樣后的拭子分別放入盛有 1.2 mL 樣品稀釋液的 2 mL 采樣管中，編號并填寫相應采樣單。

發(fā)病鵝可無菌采集氣管、肺、腦、腸（包括內(nèi)容物）、肝、脾、腎、心等組織臟器，裝入 15 mL 或 50 mL 帶螺口的有機材料保存管中，編號并填寫相應采樣單。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

將棉拭子充分捻動、擠干后棄去拭子；糞便，研碎的組織加 PBS 充分研磨，按照 1g 組織加 10 mL PBS 的比例配成懸液。樣品液經(jīng) 3 000 r/min 離心 10 min，取上清作為核酸檢測材料。

1.2核酸提取

推薦采用公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取， 請按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：

試劑GIV-U 反應液酶液

用量19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL /管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇：檢測通道（ReporterDye）FAM，淬滅通道

（QuencherDye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle50℃10min否

21 cycle95℃2min否

345 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應結束后自動保存結果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質控標準

陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果；

7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。