多功能氧化酶（(mixed function oxidase，MFO）試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                        微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

多功能氧化酶又稱(chēng)混合功能氧化酶，可產(chǎn)生降解反應(yīng)，可使原化學(xué)物質(zhì)變?yōu)榈投镜幕驘o(wú)毒的物質(zhì)從體內(nèi)排出；還可產(chǎn)生激活反應(yīng)，可使原化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有親電子性質(zhì)，導(dǎo)致毒性增強(qiáng)，成為致突變物或終致癌物。近年來(lái)對(duì)混合功能氧化酶系與外源性化學(xué)物質(zhì)相互作用的深入研究，對(duì)于從分子生物學(xué)水平上進(jìn)一步了解外源性化學(xué)物質(zhì)的毒作用具有重要意義。

測(cè)定原理：

MFO催化對(duì)硝基苯甲醚產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚，在400nm下有特征吸光值。

自備用品：

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰、蒸餾水、氯仿。

試劑組成和配制：

提取液：液體120mL×1瓶，4℃保存;

試劑一：液體24mL×1瓶，4℃避光保存;

試劑二：粉劑×3管，-20℃保存；臨用前取一管加入1.5mL水溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑三：液體24mL×1瓶，4℃保存;

試劑四：液體64mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液（mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、   酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400nm。

2、在EP管中依次加入如下試劑

分別加入1000μL氯仿，充分混勻萃取，靜置10min，取下層氯仿層0.6mL至新的EP管中。再加入試劑四0.6mL，充分混勻萃取，取上層水相0.2mL于96孔板中，400nm下測(cè)定吸光值A測(cè)定與A空白，△A=A測(cè)

定-A空白。空白管只需測(cè)一管。

MFO活性計(jì)算:

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 0.0119x + 0.0021，R² = 0.9997；y，吸光度；x,標(biāo)準(zhǔn)品濃度，單位nmol/mL。

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每g樣本每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

MFO（nmol/min/g 鮮重）=（△A-0.0021）÷0.0119×V總÷(V樣÷V樣總×W)÷T

                        =8.4×（△A-0.0021）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

MFO（nmol/min/mg prot）=（△A-0.0021）÷0.0119×V總÷(V樣×Cpr)÷T

                        =8.4×（△A-0.0021）÷Cpr

V總：最終萃取液體積，0.6 mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，200μL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL。