L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（Gal LDH）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

                                                微量法 100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

L-半乳糖途徑是合成AsA的主要途徑。Gal LDH位于線粒體內(nèi)膜，負(fù)責(zé)催化植物體內(nèi)AsA生物合成的最后一步，也是該途徑的關(guān)鍵酶之一，對(duì)植物體內(nèi)AsA含量的積累起著至關(guān)重要的作用。

測(cè)定原理：

Gal LDH催化L-半乳糖內(nèi)酯還原細(xì)胞色素C(Cyt c)，還原型Cyt c在550nm有吸收峰；測(cè)定還原型Cyt c增加速率，來(lái)計(jì)算Gal LDH活性。

自備儀器和用品：

臺(tái)式離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入16mL蒸餾水，充分溶解。

試劑三：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水，充分溶解。

粗酶液提取：

照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。13000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

Gal LDH測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到550nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。

3.依次在、微量玻璃比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL預(yù)熱的試劑二和20μL試劑三，迅速混勻后于550nm比色，記錄10s和130s的吸光值A1和A2，△A = A2﹣A1。

Gal LDH活性計(jì)算公式：

使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

Gal LDH活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原1nmol Cyt c 為1個(gè)酶活單位。

Gal LDH (nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（Cpr×V樣）÷T

=578×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

Gal LDH活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘還原1nmol Cyt c 為1個(gè)酶活單位。

Gal LDH (nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（W×V樣÷V樣總）÷T

=578×△A ÷W

ε：還原型Cyt c摩爾消光系數(shù)，17.3×10³L/ mol/cm；d：96孔板光徑(cm)，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=0.0002 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。

注意事項(xiàng):

試劑二和試劑三配制好后3天內(nèi)使用完。