半胱氨酸（cysteine, Cys）含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                                  微量法100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

蛋白質(zhì)含有三種含硫氨基酸：甲硫氨酸、胱氨酸和Cys。其中，Cys是唯yi一種含有巰基的含硫氨基酸，從甲硫氨酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，并且可與胱氨酸互相轉(zhuǎn)化。Cys參與蛋白質(zhì)二硫鍵的形成，經(jīng)常是蛋白質(zhì)活性中心的組成部分，還可以為其它生理生化反應(yīng)提供巰基。此外，Cys大量積聚在皮膚和粘膜表面，在角蛋白生成中維持重要的巰基酶的活性，并且補(bǔ)充巰基，以維持皮膚的正常代謝，調(diào)節(jié)表皮最下層的色素細(xì)胞生成的底層黑色素。具有美白、解毒、改善炎癥和過(guò)敏性皮膚等作用。

測(cè)定原理：

Cys還原磷鎢酸生成鎢藍(lán)，在600nm處有吸收峰；通過(guò)600nm吸光度，計(jì)算Cys含量。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、85％磷酸和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。用前1天，向試劑三中加2.5mL蒸餾水充分溶解，再加85％磷酸0.625mL，混勻后蓋緊（防止水分散失）沸水浴2h；冷卻后加10mL蒸餾水，4℃可保存2周。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1瓶，臨用前加10 mL蒸餾水，充分溶解。1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液，4℃避光保存。用不完的試劑4℃可保存3天。

半胱氨酸提取：

1、   液體樣品中半胱氨酸提取：取0.1mL液體樣品，加試劑一0.9mL，充分混勻，8000g

4℃離心10min，取上清液，待測(cè)。

2、   組織中半胱氨酸提取：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，8000g 4℃離心10 min，取上清液待測(cè)。

3、   細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到600 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL蒸餾水，100μL試劑二，100μL試劑三，混勻后室溫靜置15 min，于600nm處測(cè)定吸光值，記為A空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL標(biāo)準(zhǔn)液，100μL試劑二，100μL試劑三，混勻后室溫靜置15 min，于600nm處測(cè)定吸光值，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管：取微量石英比色皿/96孔板，加入20μL上清液，100μL試劑二，100μL試劑三，混勻后室溫靜置15 min，于600nm處測(cè)定吸光值，記為A測(cè)定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要做一次。

計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1. 按液體樣品的體積計(jì)算：

半胱氨酸含量（μmol/mL）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×（V樣總÷V樣）=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算：

半胱氨酸含量（μmol/g 鮮重）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×（V樣總÷V樣）÷W=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷W

3. 按照蛋白濃度計(jì)算：

半胱氨酸含量（μmol /mg prot）= [C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷（V樣×Cpr）=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷Cpr

4. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細(xì)胞數(shù)量）=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，1 μmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.02mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積，0.02 mL；V樣總：樣品提取液，1mL；W：樣品質(zhì)量，g。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1. 按液體樣品的體積計(jì)算：

半胱氨酸含量（μmol/mL）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×（V樣總÷V樣）=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)

2. 按質(zhì)量計(jì)算：

半胱氨酸含量（μmol/g 鮮重）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]×（V樣總÷V樣）÷W=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷W

3. 按照蛋白濃度計(jì)算：

半胱氨酸含量（μmol /mg prot）= [C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)]÷（V樣×Cpr）=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷Cpr

4. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

氨基酸含量（μmol /10⁴ cell）=[C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)] ×（V樣總÷V樣×細(xì)胞數(shù)量）=1×(A測(cè)定管－A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，1 μmol/mL；V標(biāo)準(zhǔn)品：反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積，0.02mL；V樣：反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積，0.02 mL；V樣總：樣品提取液，1mL；W：樣品質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)：

最di檢出限為100μmol/L。